摘要

书写训练显示出在帕金森病（PD）中具有临床益处，尽管保留效果有限且转移效果不足。目前尚不清楚阳极经颅直流电刺激（atDCS）是否能够增强帕金森病的巩固作用，以及它如何与药物治疗相互作用。研究在服用和不服用药物的情况下，训练+经颅直流电刺激（training+atDCS）和训练+虚假刺激（training+sham stimulation）对书写技能巩固的影响。其次，研究干预对皮层兴奋性的影响。在这项随机的伪对照双盲研究中，患者接受了使用atDCS（N = 20）或虚假刺激（N = 19）的书写训练（**课），目标是脑的初级运动皮质。培训旨在优化振幅，并在在线实践、培训前后、保留 24 小时以及持续学习后（第二课，隔2个月）进行评估，其中包括服药和不服药的情况。主要结果是维持期书写振幅。皮层兴奋性和抑制性在训练前后进行了评估。在服药状态下，训练+经颅直流电刺激(atDCS)可以有效提高书写振幅，而训练+虚假刺激则不能（p=0.017，g=0.75）。在两种药物状态下，通过atDCS可以增强转移至其他书写任务的能力（g值介于0.72至0.87之间）。此外，训练+经颅直流电刺激（atDCS）可以提高持续学习的效果。但在练习时和在进行双重任务写作时，没有发现在线效果。观察到训练+直经颅直流电刺激（atDCS）组（p=0.039）在训练后具有皮层抑制增加的现象，无论是否使用药物，而虚假刺激组则没有。我们表明，在书写训练期间应用atDCS能够增强帕金森病的大多数巩固结果，但并非所有结果都能增强。我们推测，在药物的作用下，经颅直流电刺激（atDCS）通过抑制过程，调节运动学习巩固。

介绍

   帕金森病（PD）是一种进行性多系统障碍，其特征是多巴胺能神经元的选择性丧失。运动学习已被证明长期训练对帕金森病患者微写症和其他手部灵活性问题具有一定的的影响 [1，2]。然而，这些收益的不稳定性也已经被证明 [3, 4]。对于健康人来说，提高运动学习的一种可能有效的工具是阳极经颅直流电刺激（atDCS）[5]。一项最近的系统评价发现在PD患者中针对atDCS对上肢运动表现的影响研究到目前为止存在研究方法质量低的问题 [6] 。关于学习方面，我们自己的试点工作表明，一次写作培训与atDCS相结合可以提高记忆和转移[7]，但最近一项关于运动序列学习的研究并未证实这一点[8]。这些相互矛盾的结果启发了当前的研究，采用了基于功效的样本量、更具挑战性的书写任务和并行设计。

   纹状体和小脑环3522集团的新网站过诱导长时程增强（LTP）来促进神经可塑性，从而调节运动学习 [9] 。这些电路的赤字，比如在PD中表现出来，改变了运动学习过程[10,11]。运动学习涉及不同的阶段，包括技能习得和巩固[12]。PD似乎特别影响巩固过程，其中体现为学习转移、自动化效应（例如双重任务干扰）和记忆保留的减少[10, 13]。初级运动皮层（M1）在运动网络中起着关键作用，因此是atDCS电极配置的主要研究区域之一[14，15]。事实上，一次M1区的atDCS会引起LTP样的可塑性，不断的刺激会导致健康受试者更稳定和持久的LTP[16]。然而，多巴胺对帕金森病患者的运动学习[2，17]和皮层兴奋性[18]的影响也不一致，因此，当atDCS与运动实践结合应用时，其效果也可能会随多巴胺能状态的不同而变化。

    为了回答这些开放性问题，我们主要旨在调查与虚假电刺激相比，在书写训练期间应用于M1的atDCS的效果。我们假设训练+atDCS将加强书写技能的巩固，在24小时的振幅保持方面将比训练+虚假刺激有所改善（主要结果）。作为次要目标，我们对三个其他巩固结果的评估也感兴趣：(1) 能够将学习应用到未受训练的任务； (2) 能够抵抗双重任务干扰； (3) 能够在第二次学习中继续学习。我们还研究了实际练习过程中的在线电刺激效果。最后，我们通过使用经颅直流电刺激（atDCS）和多巴胺能药物探索运动皮层兴奋度的结果，来研究atDCS增强的运动学习和多巴胺能药物之间的相互作用。我们在药物作用和未作用时，在学习前后使用经颅磁刺激（TMS）来探索运动皮层兴奋度的结果。

实验步骤

参与者

帕金森病患者的纳入标准包括：(i) 根据英国脑库标准[19]诊断为帕金森病；(ii) 能够在稳定的药物治疗期间参与测试；(iii) Hoehn & Yahr (H&Y) 二至三级以及右侧主导症状的一级；(iv) MiniMental State Examination (MMSE) 评分≥24 [20]；(v) 不存在其他干扰性疾病或植入物；(vi) 不存在视觉空间缺陷（Rey-Osterrieth复杂图形测试得分≥32）[21]；(vii) 用爱丁堡清单测定的右手习惯[22]。 对于TMS协议，应用了以下额外的包含标准以减少变异性：(i) 静息运动阈值（RMT）<62％，和（ii）30％到70％的短间期皮层抑制（SICI）。因此，由于未对所有参与者进行皮质兴奋性测量，导致行为组和TMS组人数多少不同（请参见补充材料）。

    本研究获得了当地伦理委员会UZ/KU研究(S60893)的批准，并在开放科学框架(OSF)中进行了预注册 (//osf.io/gk5q8/)。样本量计算基于之前的试点工作，并包括10％的退出率（请参见补充材料）[7]。样本估计包括40个受试者。由于COVID19大流行，最终的样本大小为N = 39（图1）。我们招募了39名健康对照组（HC），以便与帕金森病在基线上进行比较（详见补充材料）。由于疫情导致的所有协议偏差在补充材料中描述。

实验设计

图2A显示，根据CONSORT指南[23]，采用了随机双盲设计和平行组设计。然而，在一个随机分组交叉设计中，药物治疗在atDCS和假装治疗组中进行调整，伴随着2个月的洗脱期。参与者经历了五个测试阶段。在**个熟悉阶段（T0）服用药物时，解释了协议并进行了临床测试。在T0时刻，利用TMS技术进行了热点定位，并使用头模具进行了标准化处理[7]。在T0之后，一位独立研究员进行了隐蔽的随机化程序，将受试者分配到活性atDCS或假的刺激组中。(online tool: Sealed Envelope Ltd. 2017. Simple randomization service,)。随机化是以四个为一组进行的，并且H&Y阶段（I-III）和年龄（<65岁或≥65岁）被作为分层因素。有1例患者(atDCS组)在干预后因意外副作用退出(图1)。在**个干预阶段(T1)，书写训练与20分钟的虚假刺激或atDCS相结合。在书写测试之前，也对大脑皮层兴奋性进行了前后测试。在T2阶段，24小时后，进行了无tDCS和TMS评估的记忆保留测试。在30分钟的洗脱后，他们接受了第二阶段的学习和tDCS刺激方案，以检查持续学习的能力。在另一个药物状态下，重复了相同的协议（T3和T4）（图2）。

在线练习和测试

在线练习和测试使用的是自制的书写平板电脑（采样频率=200 Hz；空间分辨率=32.5μm）。任务包括在长度为13厘米的轨迹上写下逐渐增大的序列（从1.0到2.0厘米，反映通常的书写大小），有和没有视觉目标区域，指示所需的书写大小（图2C）。该任务对药物的影响非常敏感[24]，需要产生一个随着时间逐渐增加的8字形运动模式[25]。实验对象被指示重复在舒适的速度下，以定向书写大小持续45秒。在每次试验之间都有一个休息时间（10秒）。在使用atDCS或虚假刺激进行在线练习期间，患者在每种条件下进行了三个六次试验的区块，随着时间的推移逐渐减少反馈（即视觉目标），以优化学习[26]。在**个区块中，66%的试验有目标区域，在第二个和第三个区块中分别有50%和33%的试验有目标区域。每个区块中是否有目标的试验顺序是随机排列的。对平板电脑进行训练和未训练的任务进行了评估，没有使用atDCS，并且每个时间点包括2次试验（前、后和24小时后随访）。

   主要结果是在训练了一定序列但未包含目标的情况下，24小时保持期的振幅与先前和后绩效进行比较。

一个未经训练的'O'序列的振幅，由于难度相等，被用来测试近期过渡效果。为了研究远转移效果，使用了系统筛查手写困难（SOS）测试对纸质日常生活书写进行评估（图2B）。为了测试受试者抵御双重任务干扰的能力，在同时书写时，需要计数高频和低频音调。在线获取是通过比较训练任务中没有目标的重复测量来量化的。其他次要指标包括按目标书写、书写速度（厘米/秒）、错误（毫米）和书写表现指数（WPI）（见补充材料）

经颅直流电刺激

    在在线练习中，通过TMS程序（见附录材料），在左侧M1上施加了20分钟的atDCS或虚假电刺激，并将阴极电极放置在对侧眶上区（atDCS组的平均接触阻抗为5.5±1.1 kΩ，虚假组为8.6±2.3 kΩ）。采用1毫安的刺激强度，因为这个剂量在之前的研究中证明有效[7]。tDCS通过两个盐水浸泡的海绵电极施行，电极面积为5cm×7cm（即电流密度为0.03毫安/平方厘米）。参与者和实验者在tDCS刺激（DCStimulator，NeuroConn GmbH，德国）的“study mode”中不知道刺激类型（阳极或虚假刺激）。在这种模式下，被盲的研究人员使用由独立研究人员提供的一个文件数字，该数字编码了刺激类型。所有的实验中，刺激都是由同一位研究人员进行的。每次刺激前后都使用tDCS问卷[28]来监测副作用。每个疗程后都使用视觉模拟量表（VAS）来检查盲法。研究完成后，参与者被要求猜测自己是否接受了真正的tDCS治疗还是虚假治疗。

皮质兴奋性评估

    补充资料提供了TMS程序的详细描述，包括热点识别和数据处理。根据标准定义，在每次TMS测量开始时，对每个参与者都指定了安静状态下的运动阈值（RMT）[29]。采用单脉冲经颅磁刺激技术 (Singlepulse TMS)来确定峰峰幅度的运动诱发电位 (MEP)。这些测量数据包括应用测试刺激的20个脉冲，该刺激的强度为T0时确定的RMT的130％。通过计算在预先RMT值的130％处的postTMS / preTMS MEP大小比例来检查兴奋性的变化。采用成对脉冲经颅磁刺激（Paired pulse TMS）测量前后短时程抑制（prepost SICI），随机顺序应用20个单脉冲和20个成对脉冲。使用以下参数：（1）测试刺激设置为RMT的130％；（2）基于基准线下测得的SICI曲线，使抑制水平最接近50％的刺激强度作为条件刺激器;（3）刺激间隔为2毫秒。

数据处理和统计分析

   对于所有平板电脑任务，使用Matlab R2020a（The MathWorks）[30]如前所述提取书写振幅（cm）。通过计算双重任务干扰 (Dual task interference, DTI) 来评估双重任务的相对影响，其中DTI幅度 (DTIamplitude) 等于 ((双重任务表现 - 单一任务表现) / 单一任务表现) × 100。

    使用SPSS软件（版本28 SPSS，Inc.，美国）或者SAS软件（OnDemand for Academics: User's Guide. Cary, NC: SAS Institute Inc）进行统计分析，显著性水平为p < 0.05。在检查数据分布之后，进行了参数化或非参数化检验。 Mann-Whitney U检验被用来研究通过VAS评分评估的参与者盲法情况。交叉分析被用来分析参与者是否认为进行了主动tDCS或虚假治疗。使用组间统计方法检查了前测期间的群体差异。通过组内统计方法（见补充材料），检查组内药物状态和药物效应在预写能力方面发生的潜在“carryover effect”（即随着时间推移效果逐渐淡化的影响）。

    副作用、平均书写表现和皮质兴奋性结果通过具有未结构化协方差矩阵的线性混合模型进行了分析。通过Bonferroni多重比较事后检验探索了显著的交互作用。我们通过将参与者作为随机效应进行控制，解决了受试者内的差异。使用汇总标准差计算Hedges g值来衡量效应大小。副作用得分分别在每个阶段（干预或保留）进行分析。药物治疗效果被分析为固定因素组（atDCS或虚假刺激）和时间（前或后）。比较记忆保留、转移和双重任务的分析中，包括组别、时间（保留前、保留后或离线保留）和药物（服用或者不服用）作为固定因素。对于在线练习和持续学习所获得的结果，参与者间因素是组别，参与者内因素包括模块（**块、第二块或第三块）和药物。使用组别和药物治疗作为固定因素对MEP大小的事前/事后比率进行了分析。对于其他TMS结果，使用了固定因素组别、时间（预测或后测）和药物。在补充材料中提供了一项探索性的ANCOVA分析，分析了书写表现的变化与皮层兴奋性之间的关系。

结果

盲法和临床结果

随着时间推移，不同组间的副作用没有差异（GROUP*TIME没有显著交互作用）。同样，在atDCS或虚假刺激后，刺激强度的VAS评分显示没有显著的组差异（干预关闭U = 177.000，p = 0.728；保留关闭U = 152.500，p = 0.296；干预开启U = 169.000，p = 0.751）；保留开启 U = 163.500，p = 0.624）(图S1)。参与者和实验者两者盲法评估方面也没有显著差异（表S1）。表1显示，除了疾病持续时间在安慰剂组中显著更长（U = 266.500，p = 0.030）之外，所有临床结局的各组间相似。表2还显示，基线时各组在所有书写和大脑皮层兴奋性结果方面类似。药物显著地提高了tDCS组未训练任务的振幅，但没有发现其他药物效应（图3B）。

书写巩固

发现了训练任务无目标幅度的重要的组别*时间*药物交互作用（F（2,36）=4.389，p=0.020）。没有药物干预的情况下，存在显著的组别*时间交互作用（F(2, 37) = 3.273，p = 0.049）。事后分析显示，训练+atDCS组在书写方面表现显著更好，p = 0.004，g = 0.96）。在药物治疗下，出现了无显著组别*时间交互作用（F(2,36) = 2.827，p = 0.072）。由于其临床意义，我们进行了事后探索结果，发现在训练+ atDCS后，患者在保持记忆时书写的显著更大，相比训练+虚假刺激(p = 0.017，g = 0.75)(图3A)。

类似但更强的结果模式也被发现在近转移方面，即通过未经训练的“O”任务振幅变化来表达。训练 + atDCS组和训练+虚假刺激组之间的差异是显著的（GROUP*TIME F(2, 37) = 21.294, p < 0.0005 ），后续测试证实了这一结果。随着时间的推移，书写时和保留期间，书写显著缩小（分别为p = 0.006和p = 0.005，g在0.56至0.92之间）。没有找到与药物互动的影响，但是当处于“ON”状态时，被试的书写幅度比处于“OFF”状态时更大（主效应：F（1，36）= 7.650，p = 0.008）（图3B）。分析远距离转移的结果，即通过纸上书写的SOS分数，显示出组别*时间交互作用F(2, 37) = 15.097，p < 0.0005显著差异。事后分析显示，在训练+经颅直流电刺激(atDCS)组比在训练+虚假刺激(sham)组，保留期间书写质量显著提高（p = 0.011，OFF g = 0.78，ON g = 0.76）。

在双重任务书写方面，未发现重要的交互作用。总体来说，药物改善（降低）了DTI振幅（主效应：F（1，36）=6.199，p=0.018）（图3C）。其他次要的书写变量没有显示出重要的组别*时间改变（表格S2）。这些结果表明，训练+atDCS改善了书写的保留和迁移，效果显著（g>0.75），与药物使用无关。

在线练习和持续学习   

在药物治疗下，患者在**次在线练习期间书写的振幅比未服用药物时更大，与刺激模式无关(主要效应:F(1,36) = 13.272, p = 0.001)。所有参与者都发现，随着时间的推移，他们的成绩普遍提高（主效应： F(2, 37) = 4.984, p = 0.012)，与**区块相比，第二区块的书写量明显增加（p = 0.010），第三区块不明显（p = 0.062）。没有表现出明显的组效应（图S2）。

至于继续学习，在24小时保留测试后的评估显示了一个显著的组别*时间的交互作用，F（2，36）=4.933，P = 0.013）。事后检验显示，与训练+虚假刺激组相比，训练+atDCS组在第2和第3块期间写出了更大的尺寸（resp. p = 0.009和p = 0.035）（图S2）。综上所述，虽然在最初的在线练习阶段，atDCS没有明显的有益影响，但持续的学习却被tDCS所加强。

大脑皮层兴奋性

对于RMT和单脉冲MEP峰顶振幅，统计分析没有发现明显的相互作用（RMT：F（1，30）=1.544，p=0.224；MEP：F（1，22）=1.208，p=0.284）（图S3A，表S2）。然而，对皮层兴奋性结果的分析显示了SICI的显著交互作用效应（GROUP*TIME：F（1, 28）= 7.101，p = 0.013）。事后分析显示，训练+ atDCS组在术后相比术前出现的抑制增加（SICI值减少）（p = 0.039），而安慰组呈现非显著性减少（p = 0.120）。此外，训练+ atDCS组相对于训练+ 虚假刺激组具有更多的后抑制趋势（p = 0.060）（图S3B）。TMS参数在ON和OFF中没有差异，并且与药物治疗的相互作用并不显著（图S3）。然而，探索性相关分析显示，训练+ atDCS组（药物治疗期间）的较低SICI和更大振幅收益（前抑制）之间存在微弱但显著的负相关关系（β = -0.002，p = 0.022），在安慰组中没有明显表现（见补充材料）。

讨论

这是**项基于功效的随机双盲研究，探讨了atDCS与虚假刺激在促进书写训练在帕金森病中的影响。与我们的假设一致，一次训练+atDCS相对于训练+虚假刺激，在24小时保留、转移和持续学习方面表现更好。在线实践并没有受到tDCS补充的影响，对DT的弹性也没有增强。药物对书写表现有影响，但并没有改善学习效果。刺激的效果在两种药物状态下基本相似，只有训练+atDCS仅在ON状态下改善保持能力。至于机制，我们发现在atDCS组中训练后出现了增加的抑制信号（SICI减少），而在虚假刺激组中不存在。

研究结果表明，在训练24小时后，atDCS + 训练有助于促进早期可塑性，并促进了“近”(未经训练的序列)和“远”(自发书写)的迁移。效果大小相当可观，并在持续学习中产生了剩余效果。在健康受试者中，还表明atDCS改善了力控制任务的保留率[33]。然而，在序列任务上没有复制这种效应[31]。早些时候，我们证明了一项为期6周的强化康复计划没有使用tDCS就可以改善传统书写技巧的振幅，但这些好处在纸张上书写时并未得到维持[1]。这强调了寻找患者友好的方法以提高PD中运动学习转移的重要性。

在当前研究中，我们采用比以往更具挑战性的学习范式，需要在逐渐减少的目标线的基础上书写越来越大的振幅，以便能够衡量短期学习效果。tDCS相关的变化没有影响到在线练习，但随着时间的推移大多修改了学习方式[32，33]。由于虚假刺激组在保留阶段倾向于恶化其书写能力，因此我们对研究结果的解释需要进一步反思。我们对虚假刺激组书写能力的下降没有解释，因为基线表现在组之间是可比的。这可能反映出在没有tDCS的情况下练习这项相当困难的任务很快就被遗忘了。因此，tDCS通过增加持续学习的易感性来扭转这一趋势是合理的。tDCS效果涉及多个巩固标记的一致性，即保留、转移和持续学习，也强调了学习的特异性。但是，我们没有检查每个组的睡眠质量是否相同，因此无法完全排除可能存在的与睡眠相关的影响，尽管在一项关于健康对照组的研究中并不存在这种影响。

有趣的是，TMS分析显示tDCS +训练组表现出抑制性变化，而安慰剂组没有发现这种变化。先前，tDCS协议被提出用于优化大脑中兴奋和抑制信号传递之间的平衡（即稳态可塑性）[34]。本研究发现的抑制水平是否实际上导致巩固收益无法通过我们的数据得到证实。然而，越来越多的研究表明，大脑中的主要抑制性神经递质是γ-氨基丁酸 (GABA)，在健康老龄化过程中，对运动表现和学习产生影响[35,36]。在PD中，研究揭示了抑制性变化与肌张力过缓的严重程度[37,38]密切相关，并与经过重复TMS预处理的步态训练的长期效应有关[39]。所有这些发现都表明抑制过程在皮层LTP样可塑性中起着关键作用，并可能解释了学习结果的改善。由于多巴胺治疗引起的抑制性正常化，皮质可塑性增加和运动表现提高[11,40]。然而，交替脑电刺激被发现通过增强抑制性GABA能间神经元活动[41]来改善手指敲击，与用药状态无关。与后者的研究部分一致，我们也没有发现在用药和不用药状态下SICI水平的基线差异，但我们确实表明，在用药状态下，保持效果比不用药状态好。进一步的调查有必要确定药物和tDCS之间是否存在协同作用。

迄今为止，有报道称，对tDCS协议的存在较大的可变性[42]，这归因于参与者的临床状况和PD的认知衰退[43-45]。本研究使用年龄和疾病阶段分层随机化程序，确保了各组的临床评估和书写表现是相当的。然而，tDCS组的病程持续时间较短，这可能影响了运动学习能力和对tDCS的反应。需要注意的是，先前的研究表明，病情严重的患者倾向于展现更大的tDCS相关改善[46]。尽管如此，我们招募的轻度疾病患者的事实限制了我们工作的普遍适用性。由于TMS的资格标准，皮层兴奋性结果是基于一个小样量。由于该分析被认为是探索性的，因此没有进行单独的功率计算，但是将来的兴奋性研究需要进行。尽管存在这些缺点，我们对tDCS对转移和持续学习的积极结果感到鼓舞。未来的工作中，我们建议研究重复刺激会话、更长的随访期和不同的任务组，在将tDCS作为运动学习的辅助手段推荐给PD的临床应用之前进行研究。

总结

这项研究提供了tDCS介导下帕金森病患者书写技能保留、转移和持续学习能力的证据，很可能受到抑制过程的调节。目前的发现证明了进一步研究atDCS、运动训练和多巴胺治疗协同作用以促进帕金森病患者基于活动的可塑性的必要性。

数据可用性

本研究所得结论的数据可在合理请求的情况下由相应作者提供。

补充信息：在线版本包含可在//d oi.o rg/1 0.1007/s 00415023116693获取的补充材料。

致谢：我们感谢所有参与者的付出和支持。本研究得到了KU Leuven的内部基金（C14/17/115）和Research Foundation Flanders（FWO）的支持；SB是博士研究生（资助编号1167419N）。基金机构在研究设计、数据收集和分析、发表决定以及手稿准备方面均未参与。

作者贡献 SB：概念构建，方法论，调查研究，正式分析，资助获取，撰写原始草稿。PH：概念构建，写作-评论和编辑。BV：调查研究，写作-评论和编辑。EN：概念构建，写作-评论和编辑。GV：监督，写作-评论和编辑。RM：监督，写作-评论和编辑。JJOdX：概念构建，方法论，调查研究，监督，资助获取，写作-评论和编辑。AN：概念构建，方法论，调查研究，监督，资助获取，写作-评论和编辑。

本研究得到了库伦大学的内部资金(C14/17/115)和比利时佛兰德斯研究基金会(FWO)的支持；SB是一名博士研究员(拨款号码1167419N)。所有资助机构在研究设计、数据收集和分析、发表决定或稿件准备方面都没有扮演角色。

声明

  利益冲突 作者无利益冲突报告。伦理审批 该研究获得当地伦理委员会研究UZ/KU勒芬批准（S60893），并在开放科学框架（OSF）（//osf.io/gk5q8/）进行预登记。